Auf das Sample Pad wird die Probe aufgegeben und löst bei Übergang auf das Konjugat-Pad die dort aufgebrachten Antikörper-Goldnanopartikel-Konjugate zur Erkennung des Analyten. Über Kapillarkräfte fließt die Probe mit den Antikörper-Goldnanopartikel-Konjugaten auf der Nitrocellulosemembran zur Testlinie, auf der in Abhängigkeit von der Konzentration des Analyten ein Signal entsteht. Auf der Kontrolllinie wird durch Binden des Antikörper-Goldnanopartikel-Konjugats über eine Sekundärantikörper ein Signal sichtbar, was den erfolgreichen Test anzeigt. Das Absorbent Pad hat die Funktion die Probenflüssigkeit aufzunehmen und sorgt für einen kontinuierlichen Fluss.
Bei Corona-Schnelltests und Schwangerschaftstests kommt als Testformat der Sandwich-Assay zum Einsatz, da es sich bei Coronavirus und Schwangerschaftshormon um große Analyten handelt. Auf der Testlinie wird dafür ein spezifischer Antikörper für den Analyten immobilisiert, sodass der Analyt letztendlich in einem „Sandwich“ zwischen dem Antikörper auf der Testlinie (Fängerantikörper) und dem Antikörper am Goldnanopartikel (Detektionsantikörper) gefangen wird. Goldnanopartikel weisen eine intensiv rote Farbe auf und sind damit gut als Markierung in Lateral Flow Tests geeignet. Beim Sandwich-Assay steigt die Signalintensität auf der Testlinie mit der Analytkonzentration.
Für den Nachweis kleiner Moleküle (< 1000 Da) ist der Sandwich-Assay nicht geeignet, da es bei kleinen Molekülen sterisch nicht möglich ist, dass zwei Antikörper gleichzeitig an sie binden. Daher wird ein alternatives Testformat benötigt. Hierfür wird auf der Testlinie der Analyt(derivat) immobilisiert, sodass der Detektionsantikörper nur noch an der Testlinie binden kann, wenn er noch freie Paratope aufweist. Da bei diesem Testformat der Analyt in der Probe mit dem Analyt(derivat) auf der Testlinie um die Paratope des Detektionsantikörpers konkurriert, wird es kompetitiver Assay genannt.
