Biopolymere: Analytik von Oligosacchariden, Proteinen und Peptiden und ihre posttranslationalen Modifikationen

Elektromigrative Trenntechniken eignen sich hervorragend für die Protein- und Peptidanalytik, da für alle Analyte eine ausreichende Ladung für die Elektromigration erreicht werden kann. Im Gegensatz hierzu sind die in der Regel genutzten chromatographischen Techniken (RPLC und HILIC) abhängig von der Polarität der Analyte, sodass nicht immer alle Peptide oder Proteine einer Probe in einem analytischen Lauf erfasst werden können. Wir nutzen verschiedene Modi der elektromigrativen Trenntechniken: Kapillarelektrophorese, isoelektrische Fokussierung und die Größentrennung mittels Kapillarsiebelektrophorese (CE-SDS).

Problematisch kann in der Kapillarelektrophorese die Adsorption der Analyte an der Kapillarwandung sein, die wir durch geeignete Coatingstrategien vermeiden können. Sehr erfolgreich wurden kritische Peptide aus dem Bereich der Diagnostik und Therapie der Alzheimererkrankung, die aufgrund der extremen physikochemischen Eigenschaften, entweder extrem polar und geladen (pI-Wert >11) oder extrem hydrophob, nur schwer mit chromatographischen Techniken zugänglich waren. Mit unseren Coatings konnten beide Analytgruppen mit der ansonsten gleichen Methode getrennt werden. Zur Optimierung gehören auch neue Wege im Bereich der Kapillarcoatings, die wir nicht nur zur Vermeidung von Proteinadsorption auf der Kapillarwandung einsetzen, sondern auch, um gezielt den sich ausbildenden elektroosmotischen Fluss zu optimieren und damit die erreichbare elektrophoretische Auflösung zu verbessern. Die Detektion erfolgt in der Regel mit der hochauflösenden Massenspektrometrie, aber auch mit UV- oder Fluoreszenz-Detektion.

Die Kopplung der isoelektrischen Fokussierung mit der Massenspektrometrie ist aufgrund der hohen Ampholytkonzentration nur sehr eingeschränkt möglich. Unser Ansatz zur Identifizierung von über IEF getrennte Proteins ist eine nachgeschaltete kapillarelektrophoretische Trennung mit anschließender MS Detektion in Form einer mehrdimensionalen Trennung.

Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen auf Proteinen ist die Glykosylierung, die aufgrund ihrer komplexen Biosynthese eine enorme Heterogenität zeigen. Mit elektromigrativen Trenntechiken lassen sich die Glykane, Glykopeptide aber auch intakte Glykoproteine analysieren. Elegant können bei pharmazeutischen Proteinen auch Deamidierungen mit der Kapillarelektrophorese charakterisiert werden. Um Biomarker zu finden, müssen wir aber zudem auch die Spannbreite an Konzentrationen von Proteinen in Plasma adressieren, was wir mit Ligandenbibliotheken erreichen wollen. Von Vorteil ist bei den Arbeiten mit endogenen Peptiden und Peptidpharmazeutika für die Diagnostik, daß für elektromigrative Trenntechniken die Polarität der Analyte keine Rolle spielt, so daß wir extrem hydrophobe und hydrophile/hoch geladene Peptide gleichermaßen analysieren können.

Weitere Arbeiten beinhalten Probenvorbereitungstechniken, um den enormen Konzentrationsbereich von Proteinen in menschlichem Blut zu verringern und analytisch zugänglich zu machen.

Kooperationen:

• Katalin Barkovits, Katrin Marcus, Medizinisches Proteom Center, Ruhr-Universität Bochum

Publikationen:

1. CE-MS for the analysis of amyloid beta peptides as biomarkers for Alzheimer’s disease
   K. Barkovits, M. Pattky, J. Wiltfang, C. Huhn, K. Marcus; submitted 2015
2. Strategies for statically adsorbed coatings for high separation efficiency and resolution in CE-MS peptide analysis
   M. Pattky, K. Barkovits, O. Weiergräber, C. Huhn, Meth. Mol. Biol. 2015, submitted
3. Influence of the electroosmotic flow velocity on the separation performance in CE-MS peptide analysis using different capillary coatings: a comparative study
   M. Pattky, C. Huhn, Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 225-237
4. Synthesis of nucleotide-activated disaccharides with recombinant β3-galactosidase C from Bacillus circulans
   C. Kamerke, M. Pattky, C. Huhn, L. Elling, J. Mol. Catal. B: Enzymatic 2013, 89, 73-81
5. Synthesis of UDP-activated oligosaccharides with commercial β-galactosidase from Bacillus circulans under microwave irradiation
   C. Kamerke, M. Pattky, C. Huhn, L. Elling; J. Mol. Catal. B: Enzymatic 2012, 79, 27-34
6. Robust and high-throughput sample preparation for (semi-)quantitative analysis of N-glycosylation profiles from plasma samples
   L. R. Ruhaak, C. Huhn, C. A. M. Koeleman, A. M. Deelder, M. Wuhrer, Methods Mol. Biol. – Quantitative Methods in Proteomics 2012 , 893, 371-385
7. Hexapeptide library as a universal tool for sample preparation in protein glycosylation analysis
   C. Huhn, L. R. Ruhaak, M. Wuhrer, A. M. Deelder, J. Proteomics 2012, 75, 1515-28
8. Protein glycosylation analysis with capillary-based electromigrative separation techniques
   M. Pattky, C. Huhn, Bioanal. Rev. 2010, 2, 115-155
9. Optimized workflow for preparation of APTS-labeled N-glycans allowing high-throughput analysis of human plasma glycomes using 48-channel multiplexed CGE-LIF
   L. R. Ruhaak, R. Hennig, C. Huhn, M. Borowiak, R. J. Dolhain, A. M. Deelder, E. Rapp, M. Wuhrer, J. Proteome Res. 2010, 9, 6655-6664
10. Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification
    L. R. Ruhaak, G. Zauner, C. Huhn, C. Bruggink, A. M. Deelder, M. Wuhrer, Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397, 3457-3481
11. IgG glycosylation analysis
    C. Huhn, M. Selman, R. Ruhaak, A. M. Deelder, M. Wuhrer, Proteomics 2009, 9, 882-913
12. A HILIC-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins
    L. R. Ruhaak, C. Huhn, W.-J. Waterreus, A. R. de Boer, C. Neusüß, C. H. Hokke, A. M. Deelder, M. Wuhrer, Anal. Chem. 2008, 80, 6119-6126
13. Das Süße im EPO - Glykoproteincharakterisierung mit Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie
    C. Neusüß, S. Vaas, C. Huhn, GIT Laborfachzeitschrift 2008, 1, 22-24