Teilprojekt C01: Regulation von MicroRNA Biogenese und Aktivität

Leitung:

Prof. Dr. Detlef Weigel

Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie

Abteilung Molekularbiologie

Spemannstrasse 35 72076 Tübingen

Tel 07071 - 601 1411

Fax 07071 - 601 1412

weigelspam prevention@tue.mpg.de

Zusammenfassung:

Neben der transkriptionellen Regulation und der Kontrolle der Proteinstabilität verfügen Zellen über ein reichhaltiges Repertoire an posttranskriptionellen Mechanismen, um die Genexpression zu modulieren. Dabei sind in den letzten Jahren aufgrund ihrer Spezifität die durch MicroRNAs (miRNAs) vermittelten Effekte auf die Stabilität von Boten-RNAs (mRNAs) in den Vordergrund gerückt. Während bei Tieren miRNAs hauptsächlich die Translation und die mRNA-Degradation durch Exonukleasen beeinflussen, spielt bei Pflanzen die ARGONAUTE (AGO) abhängige Spaltung von mRNAs eine besonders wichtige Rolle. Die Biogenese von miRNAs beginnt mit Primärtranskripten, aus denen Dicer Enzyme 21 bis 22 Basenpaare lange miRNA:miRNA* Duplices ausschneiden. Aus diesen Duplices wird einer der beiden Stränge, die miRNA, in ein AGO Protein übernommen; zusammen bilden sie einen aktiven RNA Induced Silencing Complex (RISC), der bei Pflanzen keine weiteren Proteine enthalten muss. Die miRNA wirkt als Spezifitätskomponente von RISC und erlaubt dem aktiven Komplex, an längere RNAs mit Erkennungsmotiven zu binden, die weitgehend zur miRNA komplementär sind. Diese längeren RNAs, meistens mRNAs, werden dann von RISC zerschnitten oder destabilisiert oder es wird deren Translation unterdrückt. Aufgrund der Kürze der miRNAs ist für die spezifische Aktivität von RISC das Raster, in dem miRNAs aus den Primärtranskripten, den pri-miRNAs, ausgeschnitten werden, sehr wichtig. In Pflanzen sind bereits einige Proteine bekannt, die zusätzlich zu DICER-LIKE 1 (DCL1) für die präzise Prozessierung oder die Stabilität von miRNAs essentiell sind, darunter das Zinkfingerprotein SERRATE (SE) und das RNA bindende Protein HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1). In Tieren sind außerdem mehrere Stellen bekannt, an denen diese komplexen Vorgänge in Abhängigkeit von inneren oder äußeren Einflüssen reguliert werden. Um weitere pflanzliche Faktoren zu finden, die subtilere Funktionen in der miRNA-Biogenese und -Wirkung erfüllen, haben wir vor einigen Jahren eine sensitive Methode für die schnelle Sichtung von entsprechenden Arabidopsis thaliana Mutanten entwickelt. CPL1 war das erste Protein, das wir mit dieser Methode identifiziert und dann im Detail untersucht haben. CPL1 zeichnet sich durch eine Phosphatasedomäne sowie zwei Doppelstrang-RNA-bindende (DRB) Domänen aus. CPL1 ist in D-bodies zu finden, subnukleären Strukturen, in denen auch DCL1, HYL1 und SE nachgewiesen werden können. CPL1 interagiert in vivo und in vitro direkt mit SE und indirekt mit HYL1, woraus wir auf eine Gerüst- (scaffold) -funktion von SE geschlossen haben. Wir haben entdeckt, dass HYL1 durch eine unbekannte Kinase phosphoryliert wird und dass die Phosphatreste durch CPL1 entfernt werden; geschieht dies nicht, ist die Funktion von HYL1 beeinträchtigt. Im Rahmen des SFBs sollen die Untersuchungen auf drei weitere CPL Paraloge ausgedehnt werden, von denen mindestens eines redundant mit CPL1 wirkt und ein weiteres in einer miRNA-abhängigen Mutantensichtung gefunden wurde. CPL1 und CPL2 sind für den männlichen Gametophyten essentiell. Es ist nicht unwahrscheinlich, dass der Doppelknockout auch embryonal letal ist. Deshalb sollen cpl1 cpl2 Defekte im Detail mit denen von dcl1 und se, die ebenfalls für die Embryonalentwicklung essentiell sind, verglichen werden. Anschließend werden wir weitere Proteine, die wir in der oben beschriebenen Mutantensichtung identifiziert haben, studieren. Hinweise auf die genaue Rolle dieser Proteine sollen sich aus ihrer subzellulären Lokalisation, aus ihren Interaktionen mit anderen, für miRNA-abhängige Prozesse wichtigen Proteinen, sowie aus ihren Auswirkungen auf andere kleine RNAs (wie siRNAs) ergeben. Im dritten Teil des Teilprojekts werden wir untersuchen, warum dcl1, se, hyl1 und cpl1 cpl2 nur zum Teil in ihren mutanten Phänotypen überlappen. Wir wollen deshalb das Spektrum der RNAs, mit denen diese Proteine interagieren, analysieren. Zu diesem Zweck sollen Methoden für die RNA-Immunopräzipitation mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung (RIP-seq) entwickelt werden. Zusammen werden diese Untersuchungen zu einem besseren Verständnis miRNA-abhängiger Prozesse bei Pflanzen und den Unterschieden und Ähnlichkeiten in der miRNA-Biogenese und -Wirkung zwischen Pflanzen und Tieren führen.